Technologia otrzymywania białek rekombinowanych

Wiadomości z dziedziny biochemii oraz genetyki molekularnej.

przedmiot obowiązkowy

Godziny realizowane z udziałem nauczycieli (40 godz.):

- udział w wykładach - 10 h

- udział w ćwiczeniach - 15 h

- udział w konsultacjach -15 h

W1 - Zna sposoby projektowania białek o znanej lub nowej strukturze i funkcji - K_W07, K_W08

W2 - Wybiera metody oczyszczania białek rekombinowanych - K_W04, K_W05, K_W15

W3 - Ma wiedzę w zakresie procesów fałdowania i agregacji białek – K_W08

W4 - Zna metody badań oddziaływań białko-białko – K_W05

W5 - Zna podstawowe pojęcia dotyczące działalności przedsiębiorstwa i zarządzania przedsiębiorstwem – K_W21

W6 - Rozróżnia zarządzanie przedsiębiorstwem od zarządzania produkcją – K_W21

W7 - Tłumaczy specyfikę procesów biotechnologicznych – K_W08

U1 - Opracowuje protokół otrzymywania wybranych przykładów białek rekombinowanych - K_U02, K_U06, K_U15

U2 - Wykorzystuje techniki biologii molekularnej i biochemii do produkcji białek rekombinowanych w bakteryjnych i drożdżowych systemach ekspresyjnych oraz metodą koekspresji dwóch białek - K_U07

U3 - Planuje proces wytwarzania nowego produktu - K_U06

U4 - Krytycznie ocenia przygotowane projekty nowych produkcji - K_U03, K_U05

K1 - Wykazuje aktywną postawę w upowszechnianiu pozytywnego wizerunku biotechnologii w życiu człowieka - K_K11, K_K08

K2 - Dostrzega konieczność stosowania metod ekonomicznych w organizacji procesów biotechnologicznych - K_K10

K3 - Jest zdolny do rozwijania indywidualnej przedsiębiorczości - K_K12

Metody dydaktyczne podające:

- wykład informacyjny z prezentacjami multimedialnymi

Metody dydaktyczne poszukujące:

- ćwiczenia laboratoryjne mają charakter doświadczalny (studenci realizują zadania w parach). Zajęcia są prowadzone w grupie 8-12 osób, ponieważ wymaga tego metodyka doświadczeń: dostęp do sprzętu i urządzeń laboratoryjnych, a także praca z odczynnikami chemicznymi. Ćwiczenia laboratoryjne prowadzone są w salach o ograniczonej ilości stanowisk, realizowane zadania wymagają precyzji, wykonywane są na specjalistycznym sprzęcie w parach.

Wykonywanie eksperymentów pod opieką prowadzącego, w oparciu o pisemne instrukcje.

- wykład informacyjny (konwencjonalny)

- ćwiczeniowa
- doświadczeń
- laboratoryjna

Przedmiot realizowany jest w formie wykładów i ćwiczeń laboratoryjnych.

Na wykładzie studenci zapoznają się ze technikami otrzymywania, oczyszczania oraz wykorzystania białek rekombinowanych. Omówione zostaną zalety i wady poszczególnych rozwiązań technicznych, najczęstsze przyczyny niepowodzeń oraz sposoby poprawy wydajności produkcji białek rekombinowanych.

W części praktycznej studenci będą mieli możliwość zapoznania się z produkcją białek rekombinowanych w systemie bakterii gram-dodatnich, techniką koekspresji dwóch białek oraz metodami oczyszczania i analizy rekombinowanych peptydów

Przedmiot realizowany jest w formie wykładów i ćwiczeń laboratoryjnych

Na wykładach zostaną omówione następujące tematy:

1. Wprowadzenie do podstawowych problemów i technik inżynierii genetycznej

2. Projektowania oraz wytwarzania białek o zmodyfikowanej strukturze i/lub funkcji

3. Wykorzystanie prokariotycznych oraz eukariotycznych systemów ekspresyjnych do syntezy białek

4. Czynniki wpływające na wydajność transkrypcji i translacji,

5. Najczęściej spotykane problemy i ich możliwe rozwiązania w eksperymentach nadekspresji białek w komórkach E.coli; procesy fałdowania i agregacji białek w komórce,

6. Systemy wydzielania białek,

7. Metody wprowadzania mutacji i tworzenia białek fuzyjnych,

8. Zwiększanie skali podczas tworzenia nadprodukcji białek

9. Przykłady wykorzystania białek fuzyjnych w medycynie i przemyśle

Ćwiczenia będą obejmować nastepujące zagadnienia:

Zajęcia organizacyjne. Zapoznanie z zasadami bhp w laboratorium badawczym. Omówienie warunków zaliczenia kursu. Zapoznanie z aparaturą wykorzystywaną w trakcie ćwiczeń.

Klonowanie genów do wektorów ekspresyjnych. Transformacja bakterii Escherichia coli i hodowla w celu uzyskania w nadprodukcji białek rekombinowanych.

Metody tworzenia białek fuzyjnych. Rodzaje nakładek. Oczyszczanie oraz detekcja białek rekombinowanych.

Czynniki wpływające na wydajność translacji, procesy fałdowania i agregacji białek w komórce.

Praca doświadczalna:

Przygotowanie plazmidu pGEX-6P-2 do klonowania – trawienie wektora enzymem restrykcyjnym XhoI, elektroforeza preparatywna zlinearyzowanego i defosforylowanego końcuów plazmidu

Przygotowanie insertu PnCDPK do klonowania – Trawienie enzymem XhoI plazmidu pTZ57R/T niosącego wstawkę ORF genu PnCDPK1, analiza elektroforetyczna, oczyszczanie otrzymanej wstawki, spektrofotometryczne określenie ilości

Ligacja wektora pGEX-6P-2/XhoI z fragmentem PnCDPK/XhoI, transformacja komórek kompetentnych E. coli linii BL21 wektorem pGEX-PnCDPK1

Ekspresja rekombinowanego plazmidu pGEX-PnCDPK1 w komórkach BL21 w celu otrzymywania białka rekombinowanego i uzyskania jego naprodukcji.

Oczyszczanie białka fuzyjnego i rekombinowanego przy użyciu wybranych technik chromatograficznych.

Analiza białkowych produktów ekspresji z wektora z użyciem SDS-PAGE i Western-blott z użyciem specyficznych poloklonalnych przeciwciał

Literatura podstawowa:

Ratledge C., Kristiansen B., 2011. Podstawy biotechnologii. Wydawnictwo Naukowe PWN.

Turner P.C., McLennan A.G., Bates A.D., White M.R.H., 2007. Krótkie wykłady. Biologia molekularna. Wydanie drugie. Wydawnictwo Naukowe PWN.

Staroń A., Grabowska A., Jagusztyn-Krynicka E. K., 2008. Nadprodukcja i oczyszczanie rekombinowanych, heterologicznych białek w komórkach Escherichia coli. Postępy Mikrobiologii 47 (2): 83-95.

Nuc P., Nuc K., 2006. Produkcja rekombinowanych białek w Escherichia coli. Postępy Biochemii 52 (4) 448-456.

Gerd Gellissen (Ed.), 2005 Production of Recombinat Proteins, WILEY-VCh Verlag GmbH & Co. KGaA

Literatura uzupełniająca:

http://www.molecularfarming.com/

http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/Bialka-rekombinowane/

Metody oceniania

Wykłady podlegający kontroli- zaliczenie pisemne – K_W04, K_W52, K_W07, K_W08, K_W15, K_W21, K_U02, K_U03, K_U05, K_U06, K_U07, K_U15, K_K08, K_K10, K_K11, K_K12.

Ćwiczenia - raport końcowy – K_W04, K_W52, K_W07, K_W08, K_W15, K_W21, K_U02, K_U03, K_U05, K_U06, K_U07, K_U15,

Aktywność (tylko kompetencje) – K_K08, K_K10, K_K11, K_K12

nie dotyczy