Kolumnowa chromatografia cieczowa w badaniach biomedycznych

Student powinien posiadać wiedzę i umiejętności zdobyte w ramach przedmiotów: biochemia, chemia nieorganiczna, chemia organiczna, analiza instrumentalna.

przedmiot fakultatywny

1. Nakład pracy związany z zajęciami wymagającymi bezpośredniego udziału nauczycieli akademickich wynosi:

- wykłady: 15 h

- konsultacje związane z przygotowaniem do zajęć: 2 h

2. Czas poświęcony przez studenta na pracę indywidualną:

− przygotowanie i uzupełnienie notatek – 2 h

− czytanie wskazanej literatury – 8 h

3. Czas wymagany do przygotowania się i uczestnictwa w procesie oceniania:

− przygotowanie do zajęć będzie realizowane poprzez zapoznanie się ze wskazaną literaturą, jak określono powyżej

4. Czas wymagany do odbycia obowiązkowej(-ych) praktyki (praktyk) – nie dotyczy

Łączny nakład pracy studenta: 27 h

W1: Rozumie podstawowe terminy z zakresu kolumnowej chromatografii cieczowej (B2_W01)

W2: Zna podstawowe instrumentarium stosowane w konwencjonalnej i wysokosprawnej chromatografii cieczowej i rozumie zasady jego działania (B2_W11)

W3: Rozumie procesy rozdziału chromatograficznego w trybie chromatografii jonowymiennej, hydrofobowej, podziałowej, powinowactwa i sączenia molekularnego (B2_W17, B2_W18)

U1: Potrafi dobrać odpowiedni rodzaj chromatografii do oczyszczanej lub oznaczanej ilościowo grupy związków chemicznych (B2_U03)

U2: Potrafi zaproponować skład zestawu chromatograficznego służącego do realizacji konkretnego zadania preparatywnego lub analitycznego (B2_U02)

K1: Rozumie potrzebę samodzielnego poszerzania wiedzy teoretycznej z zakresu chromatografii i dominującą rolę praktyki, jako klucza do efektywnego stosowania technik chromatograficznych (B2_K01, B2_K03)

Wykład (metody dydaktyczne podające):

- wykład informacyjny z prezentacją multimedialną

- wykład konwersatoryjny

- wykład informacyjny (konwencjonalny)
- wykład konwersatoryjny

Celem kształcenia w ramach przedmiotu jest zapoznanie studentów z szerokim wachlarzem metod kolumnowej chromatografii cieczowej i ich zastosowaniem w preparatyce, analizie jakościowej i ilościowej. Szczególny nacisk położony jest na techniczne aspekty zastosowań chromatografii cieczowej oraz ich użyteczność w prowadzeniu badań biomedycznych.

Chromatografia cieczowa stanowi potężne i bardzo często używane narzędzie w badaniach biomedycznych. Jako technika separacyjna stanowi ona podstawę różnych metod izolacji biomolekuł np. białek, kwasów nukleinowych, sacharydów, lipidów, tysięcy związków drobnocząsteczkowych, etc. Dzięki metodom chromatograficznym dysponujemy możliwościami wyizolowania obiektu badań biomedycznych z wyjątkowo złożonych mieszanin związków, jakimi są homogenaty tkanek, lizaty komórkowe, płyny fizjologiczne, wydzieliny i wydaliny ustrojowe. W swej najbardziej zaawansowanej technicznie formie, zwanej wysokosprawną chromatografią cieczową, pozawala ona na bardzo precyzyjne oznaczanie ilościowe najróżniejszych chemicznych składników żywych organizmów, a także aktywności licznych enzymów katalizujących większość procesów metabolicznych. Świadomość preparatywnego i analitycznego potencjału licznych odmian chromatografii cieczowej oraz umiejętność ich praktycznego zastosowania stanowi ogromną zaletę pracownika podejmującego samodzielną pracę badawczą. Zadaniem wykładu fakultatywnego jest wprowadzenie słuchaczy w rozległą tematykę praktyki chromatograficznej i wdrożenie do samodzielnych prób stosowania chromatografii podczas realizacji własnych zadań badawczych.

Zakres tematów:

1. Istota procesu chromatograficznego i podstawowe pojęcia z zakresu chromatografii

1.1. Ogólna definicja procesu chromatograficznego z uwzględnieniem podstawowych pojęć:

1.2. Ogólny podział metod chromatograficznych ze względu na stan skupienia fazy stacjonarnej i fazy ruchomej:

1.3. Ogólna charakterystyka kolumnowej chromatografii cieczowej (KCC), szkic stuletniej historii jej rozwoju i zastosowań oraz wstępna charakterystyka współczesnych, naukowych i technologicznych zastosowań KCC (zastosowania preparatywne i analityczne).

2. Podstawowe instrumentarium stosowane w klasycznej (niskociśnieniowej) chromatografii cieczowej i jego działanie

2.1. Rodzaje i konstrukcja klasycznych kolumn chromatograficznych

2.2. Wężyki chromatograficzne i ich łączenie:

2.3. Rezerwuary eluentów i mieszacze gradientów:

2.4. Ogólne zasady dotyczące chemicznej i biologicznej czystości eluentów oraz sposoby ich kondycjonowania

2.5. Sposoby nanoszenia mieszanin na klasyczne kolumny chromatograficzne

2.6. Konstrukcja, zasada działania i sposób użycia kolektora frakcji w zestawie chromatograficznym

2.7. Sposoby wykrywania obecności rozdzielanych związków chemicznych we frakcjach chromatograficznych i wykreślanie chromatogramów

2.8. Omówienie możliwości rozbudowy podstawowych zestawów do klasycznej KCC o pompy perystaltyczne i detektory chromatograficzne różnych typów

3. Rodzaje kolumnowej chromatografii cieczowej w zależności od typów oddziaływań pomiędzy nośnikiem chromatograficznym a chromatografowanymi związkami chemicznymi

3.1. Mikroskopowa struktura nośników chromatograficznych stosowanych w KCC i jej znaczenie dla sprawności (rozdzielczości) chromatografii:

3.2. Chromatografia jonowymienna

3.3. Chromatografia hydrofobowa

3.4. Sączenie molekularne (chromatografia żelowa, chromatografia na sitach molekularnych)

3.5. Chromatografia powinowactwa

3.6. Chromatografia podziałowa z normalnym i odwróconym układem faz

4. Podstawy wysokosprawnej chromatografii cieczowej (High-performance liquid chromatography - HPLC)

4.1. Zasadnicze cechy odróżniające HPLC od tradycyjnej KCC:

4.2. Wymogi dotyczące stopnia czystości solwentów i składników eluentów oraz metody ich kondycjonowania

4.3. Budowa, działanie i podstawowe cechy pomp HPLC

4.4. Dozowniki próbek stosowane w HPLC i ich działanie

4.5. Rodzaje i budowa kolumn stosowanych w HPLC

4.6. Budowa, funkcja i działanie pieców (termostatów) do kolumn HPLC

4.7. Podstawowe typy detektorów stosowanych w układach HPLC i zasady ich działania (detektory UV-VIS, refraktometryczne, fluorymetryczne, elektrochemiczne, konduktometryczne, masowe)

4.8. Kryteria doboru rodzaju detektora (lub zestawu detektorów) do konkretnych zadań analitycznych realizowanych za pomocą HPLC

4.9. Reguły i procedury ilościowego oznaczania związków chemicznych rozdzielanych za pomocą HPLC

4.10. Zadania komputera i oprogramowania chromatograficznego, jako jednostki sterującej i synchronizującej pracę podzespołów HPLC oraz jako systemu akwizycji i obróbki danych chromatograficznych

4.11. Omówienie przykładowych oznaczeń ilościowych prowadzonych za pomocą HPLC z użyciem najpopularniejszych kolumn analitycznych z wypełnieniem typu C18 (chromatografia podziałowa z odwróconym układem faz na nośniku oktadecylosilanowym)

1. Witkiewicz Z., Kałużna-Czaplińska J., Podstawy chromatografii i technik elektromigracyjnych, Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, 2012.

2. Praca zbiorowa pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz, Ćwiczenia z biochemii, część II, rozdział 4: Chromatografia, Wydawnictwo Naukowe PWN (liczne wydania).

Warunkiem uzyskania zaliczenia przedmiotu jest obecność na przynajmniej 66% wykładów. Kryterium oceniania – zaliczenie na ocenę na podstawie obecności oraz aktywności podczas konwersatoryjnych fragmentów wykładu, która jest na bieżąco oceniana przez wykładowcę. Nieobecność na jednym wykładzie w szczególnych przypadkach nie pozbawia możliwości uzyskania oceny bardzo dobrej. Wymaga to jednak samodzielnego opanowania materiału wykładowego przez słuchacza, potwierdzonego w formie ustnej odpowiedzi na pytania sformułowane przez prowadzącego.

Kryteria i skala ocen:

5 100% aktywnej obecności na wykładach

4,5 100% obecności na wykładach

4 Minimum 66% aktywnej obecności na wykładach

3,0 Minimum 66% biernej obecności na wykładach

2,0 poniżej 66% obecności na zajęciach